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治，而佩里叩关造成的幕府危机又增大了各藩的发言权，身为雄藩藩主的岛津齐彬自然不甘寂寞，经常活跃在中央政局的前台。大久保利通积极协助岛津齐彬，才华日益显露，官职也由藩记录所书记，升为步兵监督，政治经验日渐丰富。
然而好景不长，保守的井伊直弼代替病死的阿部正弘成为幕府大老之后，兴起“安政大狱”，许多爱国志士惨遭屠杀。岛津齐彬恰在此时病死，井伊任命岛津齐彬之弟岛津久光之子岛津忠义为萨摩藩主，保守派开始在藩内抬头。大久保利通决心在真正的实权人物岛津久光身上下功夫，以图扭转不利局面。他发现岛津久光爱下围棋，便苦练棋艺，以便交流。听说岛津久光想看《古史传》，他便设法弄到多达28册的《古史传》分册借给岛津久光，并乘机在书中夹带纸条以让岛津久光明白自己对形势的见解。功夫不负苦心人，岛津久光终于逐渐疏远保守派，开始重用大久保利通，“精忠组”也获得了合法地位。
萨摩藩和幕府都在策划让幕府和朝廷合作以对付外来危机的“公武合体”运动，岛津久光同大久保利通一起率藩兵一千人进京，向朝廷施加压力。这样的军事行动在德川幕府时代可以说尚属首次。
就在大久保利通积极推进公武合体运动之时，早年的“精忠组”同志有马新七等人因早已投入更加激进的尊王攘夷运动，正在策划乘岛津久光进京之际袭击佐幕派公卿。大久保利通为达到自己的目的，在派人劝说无效后，断然派兵杀死有马新七等人，是为“寺田屋事件”。此事件造成公武合体派和尊王攘夷派的完全分裂，并加速了公武合体运动的进程。朝廷颁布敕命，基本满足了岛津久光的要求并宣布要改革幕政。作为公武合体运动结晶的雄藩会议筹备就绪，设置了德川庆喜、岛津久光等六人组成的“参与会议”，在天皇主持下讨论国策。然而，因各雄藩各怀私心，政见不同，德川庆喜则梦想幕府重新独揽大权，不到三个月，“参与会议”便因六参与的相继辞职而烟消云散。公武合体运动遭受重大挫折。
而尊王攘夷运动在一度沉寂之后，重新高涨起来。另一雄藩长州的藩政权回到尊王攘夷派木户孝允、高杉晋作等人手中，长州开始实行倒幕割据政策。幕府策划第二次征讨长州。本来萨摩曾在禁门之变、第一次征讨长州的战争中多次与长州兵戎相见，这时却因长州通过萨摩购买英国武器而逐渐与之接近。
大久保利通早年即有“一国割据”思想，此时看到它以另一种形式在长州实现，便逐渐转变为倒幕派。
庆应二年二月，萨长两藩在坂本龙马、中冈慎太郎的斡旋下，结成了倒幕同盟，萨摩藩与德川庆喜的友好关系从此中断。为确保倒幕成功，大久保利通与朝廷公卿岩仓具视合作，利用天皇权威，于庆应四年一月三日成功发动宫廷政变。朝廷发布的“王政复古大号令”，废除了朝廷的摄政、关白制度与幕府的征夷大将军。随后朝廷的军队击败进至京都郊外的幕府军队，在此后的戊辰战争中消灭了幕府。大久保利通则担任参谋后又任总裁局顾问处理内务，协助西乡隆盛指挥作战，从而建立并巩固了明治新政权。
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